好色客
肝癌是环球癌症探究物化的第三大原因，肝细胞癌 (HCC) 是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤。酪氨酸激酶扼制剂 (TKI) 调整疗效仍然有限，免疫检查点扼制剂 (ICIs)，如范例性细胞物化卵白-1 (PD-1) 阻断抗体，解析出比 TKI 更高的客不雅反应率和更少的总体不良反作用。然则与玄色素瘤或淋巴瘤比较，HCC 的 ICI 抗肿瘤活性仅达到中等的客不雅反应率（15%–20%）。由于 HCC 肿瘤微环境 (TME) 是高度复杂的，具有构成多样功能单元、细胞邻域 (CN) 的多种细胞因素。传统的免疫组化或免疫荧光的范例难以怡悦多参数检测的需求，从而死心了其在复杂 TME 探究中的应用。成像质谱流式时刻（Imaging Mass Cytometry，简称 IMC），独揽数十种爱戴金属象征抗体，对单个组织切片进行染色，不错同期检测数十种卵白质和卵白质修饰，并保留细胞空间信息，细则空间分辨的单细胞表型，即省略达成基于空间分辨率的 HCC TME 表型是 TME 拓扑分析的实用器具。近日，来自浙江大学梁廷波解释、盛剑鹏探究员领导的探究团队在 HCC 免疫调整范围得回了松懈进展。他们从多半亚细胞空间分辨率的卵白数据中，初度揭示了 HCC TME 的多样拓扑功能单元，同期提供了最大的 HCC 病理景不雅库，卓著了 Kupffer 细胞特异性靶向而不是全体骨髓细胞阻断行为 HCC 调整的新式免疫疗法的后劲。探究成果发表在 Gut（IF = 23.06）期刊。 这项探究独揽 IMC 量化了 134 名 HCC 患者和 7 名健康供体的 FFPE 切片样本中 36 个 marker 的抒发和定位信息，得回了 562 张亚细胞空间分辨率的高维肿瘤病理图像。图像中包含东谈主肝脏微环境区域私有的组织结构，以及主要基质细胞类型和免疫细胞群（Fig 1）。
Fig 1．IMC 得回平时肝组织包含 36 个 marker 的抒发代表性数据的高维图像。(A)marker 单色伪彩图片，箭头 1: B 细胞 (CD3- CD20+)，箭头 2: CD8+ T 细胞 (CD3+ CD8+ CD4-)，箭头 3: 中性粒细胞 (CD11b+ CD68- CD15+)，箭头 4：浸润性巨噬细胞 (CD11b+ CD68+ CD16- CD169low)，箭头 5: kuffer 细胞 (CD11blow CD68+ CD16+ CD169+)，箭头 6: 当然杀伤 (NK) 细胞 (CD68-CD16+ CD57 +)；(B) 描写肝脏组织结构，左图 Pan-keratin(青色)、αSMA(黄色)、collagen I (蓝色) 和 CD31(红色)，肝细胞呈青色，肝索、肝窦用白色虚线卓著；右图 H&E 染色，玄色虚线卓著同样结构，比例尺 100 μm。
如何将图像信息领略出来并与临床数据建立探究，成了下—步探究的要津。探究东谈主员对高维数据进行深刻挖掘。
HCC 微环境的组织拓扑分析
关于组织拓扑分析，探究东谈主员最初独揽 CellProfiler 软件分割出组织图像中的每个细胞，从而得到单细胞水平的 marker 抒发数据。将分割数据输入 hisoCAT 软件进行 tSNE 和 Pheno Graph 和细胞邻域（CN）中分析。将组织细胞别离红了 22 个元簇 (metacluster)，包括 3 个肝细胞元簇、4 个癌细胞元簇、2 个内皮细胞元簇、2 个成纤维细胞元簇和 11 个免疫细胞元簇。热图展示每个元簇中 marker 的抒发，发现很多非免疫细胞抒发 PD-1，且去分化的肝细胞 1 和 2 抒发的 PD-1 最高 (Fig 2)。
Fig 2. IMC 数据照管和分析过程。图像单细胞化后，凭证单细胞抒发数据聚成的 22 个元簇 (A) IMC 数据网罗表露图，包括组织制备、抗体染色、图像网罗与拼装、单细胞识别、细胞降维、聚类和糊口分析; (C) 热图解析元簇 marker 的平均抒发，右侧箱形图解析其在不同患者中的频率散播形式。
分析了每个肝癌患者样本中的多个区域，在 HCC 中发现了三种主要类型的 TME(I-III 型)，具有不同的基质和免疫细胞散播形式，这些形式对应于肝细胞去分化的不同阶段。I 型：肝细胞象征物， 如 pan-keratin 和 E-cadherin 强抒发，肝脏的主要结构， 包括肝窦和肝索保存完满，这标明 I 型区域雷同于平时肝组织和癌旁组织；II 型：成纤维细胞象征物，如 αSMA 和 collagenI 在区域高度富集，反馈纤维化主要发生在该区域；III 型：肝细胞失去了上皮象征物的抒发，如 pan-keratin 和 E-cadherin，教唆肝细胞发生去分化，且增殖象征物 Ki-67 在 III 型区域抒发水平高于其他区域 (Fig 3A)。CD45+免疫细胞主要存在于 I 型和 II 型区域，而 III 型区域险些莫得这些细胞 (Fig 3B)。这些成果揭示了三种主要类型 TME 和瘤内区域，推崇出肝细胞去分化，间质细胞和免疫细胞的区域特异性散播。
Fig 3. 三种主要类型肿瘤内区域的 IMC 图像。（A）E-cadherin (红色)，pan-keratin(青色)、Ki-67(绿色) 和 caspase-3(黄色) 的重叠图片，用于识别 HCC 的 I 型、II 型和 III 型区域。黄色和绿色箭头分别表露 Caspase-3 和 Ki-67 染色。（B）αSMA(红色)、collagen I (蓝色) 和 CD45(绿色) 的重叠图不雅察纤维化区域和免疫细胞散播形式。绿色箭头表露免疫细胞。白色虚线卓著纤维化区域。
单细胞分析不同 TME 中细胞的各异散播
作家进一步探究去分化过程与肿瘤微环境变化之间的关系，领受 tSNE 在单细胞水平上分析，并在 tSNE 图中添加元簇 (1-22) 郑重 (Fig 4A)。热图分析三种 HCC TME 中元簇频率 (Fig 4B)。肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞和不同的免疫细胞群分离成不同的元簇。凭证 pan-keratin 和 E-cadherin 的抒发减少，在 I 型区域有 2 个肝细胞元簇 (1-2)。元簇 1 细胞解析最强的 pan-keratin 和 E-cadherin 染色，而元簇 2 的肝细胞 pan-keratin 和 E-cadherin 抒发减少，教唆 I 型区去分化过程初始 (Fig 4C)。II 型区域的元簇 3 去分化肝细胞保握平时水平的 pan-keratin，而 E-cadherin 抒发有限 (Fig 4D)。在 III 型区域有三群癌细胞 (元簇 4-6)，短缺 pan-keratin 和 E-cadherin 染色，代表大部分去分化细胞 (Fig 4E)。因此，对高维 IMC 图像的单细胞分析详备地阐发了细胞在 I-III 型区域的各异散播。
Fig 4. 不同区域的细胞构成和功能变化。(A)tSNE 展示 HCC TME 的元簇构成；(B) 不同区域 22 个元簇频率散播热图；(C-E) 分别为 I-III 型区域 tSNE 图
咱们生活的城市由不同的社区构成 (如工业、住宅或农业)，社区是城市特定功能发生的区域，如工业产出或动力奢靡。在本探究中，TME 相称于城市，而 CN 相称于城市中的社区。作家将 CN 界说为中心细胞 4 μm 内的低级把握细胞及低级把握细胞的次级把握细胞 (Fig 5A)。凭证 CN 内的主要细胞簇对 CNs 进行郑重，分红了 16 个 CN (Fig 5B)。为了细则 CN 功能单元是否与患者预后探究，作家对拓扑功能单元与患者总糊口期 (OS) 和无进展糊口期 (PFS) 之间关系进行探索。连络 69 例未接受新缓助调整或肝移植的患者的 Kaplan-Meier 糊口分析，生成每个患者的拓扑图，遐想 CN 功能单元频率。发现癌细胞富集的 CN (CN9) 与患者 OS 和 PFS 较差探究，CD8+ T 细胞富集的 CN (CN13) 与患者 OS 延迟相关。且 KC-富集的 CN、InfM-CN 与患者预后呈相背关系。高频率 KC 富集的 CN (CN4) 与患者 OS 和 PFS 较差探究，而 InfM-CN (CN7) 较高频率与患者 OS 无显耀探究 (Fig 5D)。这些成果标明，肝癌的拓扑功能单元可能成为新的肝癌患者预青年物象征物。此外， KC 和 InfM 组奏服从相背的 CNs 肝癌 TME。KC-CN 频率高的患者预后较差，而 infM-CN 频率高的患者预后较好。
Fig 5. 肝细胞癌肿瘤微环境细胞功能单元与患者预后的探究性。(A)CN 分析范例；(B) 13 种主要的 CN 类型最初通过 CN 内的主要细胞类型进行郑重，然后通过 CN 中每个细胞类型的缩放频率 (如图 y 轴所示) 进行聚类；(D) 按照 A 所示的范例对患者的 IMC 图像进行拓扑分析，然后遐想每个患者的 CN 频率。比较不同类型 CN 频率的高或低与患者的总糊口期和无进展糊口期的关系。
Kupffer 细胞的耗尽增强肿瘤抗 PD-1 调整的反应
接下来作家构建小鼠模子，独揽 IMC 等时刻，说明了肝脏中 Kupffer 细胞的奢靡在很猛进程上增强了 T 细胞反应，减少了肝脏肿瘤的滋长何况肿瘤抗击 PD-1 调整反应明锐。卓著了 Kupffer 细胞特异性靶向而不是全体骨髓细胞阻断行为 HCC 调整的新式免疫疗法的后劲。这项探究奏效地领受 Fluidigm 的组织成像质谱流式系统对肝细胞癌肿瘤免疫微环境进行深刻的拓扑分析。与传统的免疫组化或者免疫荧光不同，IMC 领受金属元素行为抗体的标签，独揽质谱系统进行信号的检测。从旨趣上幸免了荧光串色、组织配景等因素对成果的影响，可在一次扫描中同期检测几十种卵白质，已成为肿瘤微环境拓扑分析的有用器具，是探究健康组织或病理组织的理思妙技。
参考文件：
1 Sheng好色客， J.P.， Zhang， J.L.， Wang L. et al. "Topological analysis ofhepatocellular carcinoma tumour microenvironment based on imaging mass cytometryreveals cellular neighbourhood regulated reversely by macrophages withdifferent ontogeny." Gut. 12 July 2021， doi:10.1136/gutjnl-2021-324339.